I microscopi vengono utilizzati nei vari laboratori per osservare nel miglior dettaglio e ingrandimento possibile i campioni in esame, come cellule e tessuti. Questo permette l'osservazione e lo studio di strutture che altrimenti non potrebbero essere osservate a occhio nudo. Esistono diversi tipi di microscopi, ma i principali sono il microscopio ottico, il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e il microscopio elettronico a scansione (SEM).
Esistono molte altre tipologie di microscopi utilizzati nei laboratori; i microscopi ottici ed elettronici sono solo due esempi! Altri tipi sono i microscopi a raggi X, i microscopi a sonda a scansione e i microscopi acustici a scansione.
Ingrandimento e risoluzione del microscopio
Due fattori risultano estremamente importanti quando si osserva una struttura al microscopio:
- Ingrandimento
- Risoluzione
L'ingrandimento si riferisce a quanto un oggetto è stato ingrandito.
La risoluzione descrive la capacità di un microscopio di distinguere due punti (oggetti) vicini tra loro, cioè di osservare i dettagli.
L'ingrandimento può essere calcolato come: lunghezza focale dell'obiettivo (fob) / lunghezza focale dell'oculare (foc)
Supponiamo di voler calcolare la lunghezza effettiva di una cellula della guancia. Stiamo utilizzando un ingrandimento di 12.500X e la lunghezza della cellula della guancia al microscopio è di 10 mm.
Convertiamo innanzitutto 10 mm in µm, ovvero 10.000 µm (ricordiamo che 1 mm = 1.000 µm).
Ora riorganizziamo l'equazione per calcolare la lunghezza effettiva. Questo ci dà la lunghezza dell'immagine/ingrandimento. Inserendo i nostri valori nell'equazione di riarrangiamento, si ottiene:
Lunghezza effettiva = 10.000/12.500 = 0,8 µm
I microscopi ottici hanno una minore capacità di ingrandire gli oggetti senza compromettere la risoluzione. L'ingrandimento del microscopio ottico può raggiungere 1.000-1.500X. Se confrontiamo questi valori con i microscopi elettronici, l'ingrandimento può raggiungere 1.000.000X!
Per quanto riguarda la risoluzione, i microscopi ottici possono raggiungere solo 200 nm, mentre i microscopi elettronici possono raggiungere l'impressionante valore di 0,2 nm. Che differenza!
Il microscopio ottico
I microscopi ottici ingrandiscono gli oggetti utilizzando due lenti biconcave che manipolano la luce che vi cade, facendoli apparire più grandi. La luce viene manipolata da una serie di lenti di vetro che focalizzano il fascio di luce su o attraverso un oggetto specifico.
Le componenti del microscopio ottico
Anche se i microscopi ottici possono avere parti leggermente diverse a seconda dei modelli e dei produttori, tutti contengono le seguenti caratteristiche generali.
Tavolino traslatore
Questa è la "piattaforma" dove si posiziona il campione (di solito su un vetrino). È possibile posizionare il campione utilizzando le clip del supporto dello stage.
Per campione ci si riferisce solitamente a un organismo vivente (o precedentemente vivo) o a una parte di un organismo vivente utilizzata per lo studio e la visualizzazione scientifica.
Obiettivo
Le lenti dell'obiettivo raccolgono la luce riflessa dal campione per ingrandire l'immagine.
Oculare (con lenti oculari)
È il punto in cui si osserva l'immagine. L'oculare contiene lenti oculari che ingrandiscono l'immagine prodotta dall'obiettivo.
Viti di regolazione
È possibile regolare la messa a fuoco dell'immagine ingrandita utilizzando specifiche "viti" (vite micro- e macro-metrica, e viti di traslazione) di regolazione del microscopio.
La fonte di luce
La sorgente luminosa, spesso chiamata anche illuminatore, fornisce la luce artificiale per illuminare il campione. È possibile utilizzare il controllo dell'intensità luminosa per regolare l'intensità del fascio di luce.
Il microscopio elettronico
A differenza dei microscopi ottici, i microscopi elettronici utilizzano fasci di elettroni per ingrandire l'immagine dei campioni. Esistono due tipi principali di microscopi elettronici (EM):
- Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
- Microscopio elettronico a scansione (SEM)
Microscopio elettronico a trasmissione
Il TEM viene utilizzato per generare immagini trasversali di campioni ad alta risoluzione (fino a 0,17 nm) e ad alto ingrandimento (fino a x 2.000.000).
Gli elettroni ad alta tensione vengono "sparati" tramite un cannone elettronico posto nella parte superiore del TEM e viaggiano attraverso un tubo a vuoto. Invece di utilizzare una semplice lente di vetro, il TEM utilizza una lente elettromagnetica in grado di focalizzare gli elettroni in un fascio estremamente sottile. Il fascio si disperde o colpisce lo schermo fluorescente situato nella parte inferiore del microscopio. Le diverse parti del campione appariranno sullo schermo a seconda della loro densità e le immagini potranno essere scattate utilizzando la fotocamera montata vicino allo schermo fluorescente.
Il campione studiato deve essere estremamente sottile quando si utilizza il TEM. A tal fine, i campioni vengono sottoposti a una preparazione speciale prima di essere tagliati con un ultramicrotomo, un dispositivo che utilizza un coltello di diamante per generare sezioni ultrasottili.
Le dimensioni di un mitocondrio sono comprese tra 0,5 e 3 um, visibili al microscopio ottico. Per vedere l'interno di un mitocondrio è necessario un microscopio elettronico.
Microscopio elettronico a scansione
Il SEM e il TEM sono per certi versi simili, poiché entrambi utilizzano una sorgente di elettroni e lenti elettromagnetiche. Tuttavia, la differenza principale sta nel modo in cui creano le immagini finali. Il SEM rileva gli elettroni riflessi o "abbattuti", mentre il TEM utilizza gli elettroni trasmessi per mostrare un'immagine.
Il SEM viene spesso utilizzato per mostrare la struttura tridimensionale della superficie di un campione, mentre il TEM viene utilizzato per mostrarne l'interno (come l'interno di un mitocondrio citato in precedenza).
Il polline dei fiori ha un diametro di circa 10-70 µm (a seconda della specie). Potreste pensare di poterlo vedere a occhio nudo, ma ciò che vedrete sono ammassi casuali. I singoli grani di polline sono troppo piccoli per essere visti a occhio nudo! Anche se si possono vedere i singoli grani al microscopio ottico, non si riesce a vedere la struttura della superficie. Utilizzando il SEM, il polline può apparire in forme diverse e con una superficie variamente ruvida.
Preparazione di un campione da osservare al microscopio
Il tuo campione dovrà essere preparato con cura affinché il microscopio scelto possa produrre correttamente un'immagine ingrandita.
Preparazione per il microscopio ottico
In microscopia ottica, i due modi principali per preparare il campione sono le montature umide e i campioni fissati. Per preparare una montatura umida, il campione viene semplicemente posizionato su un vetrino e viene aggiunta una goccia d'acqua (spesso viene posizionato un vetrino di copertura per fissarlo in posizione). Per i campioni fissati, il campione viene attaccato al vetrino con il calore o con sostanze chimiche e il vetrino di copertura viene posizionato sopra. Per usare il calore, il campione viene posto sul vetrino che viene delicatamente riscaldato su una fonte di calore, come un becco Bunsen. Per fissare chimicamente il campione, si possono aggiungere reagenti come l'etanolo e la formaldeide.
Preparazione per il microscopio elettronico
Nella microscopia elettronica, la preparazione dei campioni è più complessa e richiede più passaggi.
Inizialmente, il campione deve essere fissato chimicamente e disidratato per diventare stabile. Questo deve essere fatto il prima possibile quando viene rimosso dal suo ambiente (dove un organismo ha vissuto o, se si tratta di una cellula, dal corpo di un organismo) per evitare cambiamenti alla sua struttura (ad esempio, ossidazione dei lipidi o al contrario mancanza di ossigeno per altri tessuti). Invece di fissare, i campioni possono anche essere congelati, per poi essere utilizzati in fasi successive.
A parte questo, il SEM e il TEM prevedono diverse fasi di preparazione dopo il fissaggio/congelamento iniziale. Nel caso del TEM, i campioni vengono sospesi in resina, il che rende più facile "affettare" e tagliare in sezioni sottili con un ultramicrotomo. I campioni vengono anche trattati con metalli pesanti per aumentare il contrasto dell'immagine. Le regioni del campione che hanno prontamente assorbito questi metalli pesanti appariranno più scure nell'immagine finale.
Poiché il SEM produce un'immagine della superficie di un campione, i campioni non vengono tagliati ma rivestiti con metalli pesanti, come oro o oro-palladio. Senza questo rivestimento, i campioni possono iniziare ad accumulare troppi elettroni, con conseguenti artefatti nell'immagine finale.
Gli artefatti descrivono strutture del campione che non rappresentano la morfologia normale. Questi artefatti sono prodotti durante la preparazione del campione.
Campo visivo dei microscopi
Il campo visivo (FOV) di un microscopio descrive l'area osservabile nelle lenti oculari.
Esiste una formula semplice da utilizzare per trovare il diametro del campo visivo (FOV): numero di campo / numero di ingrandimento.
Il numero di campo si trova solitamente sulla lente oculare accanto all'ingrandimento oculare.
Se il numero di campo è 20 mm e l'ingrandimento è x 400, è possibile calcolare il FOV inserendo i valori nell'equazione:
FOV = 20 / 400 = 0,05 mm!
Microscopio - Punti chiave
- L'ingrandimento e la risoluzione determinano il modo in cui l'immagine viene vista attraverso le lenti oculari. Sono interconnessi.
- Il microscopio ottico è il principale microscopio utilizzato per insegnare agli studenti.
- Il microscopio elettronico a trasmissione e il microscopio elettronico a scansione sono spesso utilizzati dagli scienziati per studiare strutture molto piccole.
- I microscopi elettronici hanno una risoluzione molto più elevata rispetto ai microscopi ottici.
- Il campo visivo del microscopio è l'immagine che si può vedere guardando attraverso le lenti oculari.
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