Probabilmente, tra i primi esperimenti che hai fatto nel laboratorio di chimica, hai eseguito un esperimento di cromatografia su carta per separare un inchiostro colorato. Come funziona? Si traccia una linea a matita sul fondo di un foglio di carta, si aggiunge un puntino di inchiostro sulla linea e si mette la carta in verticale in un becker con del solvente. Il solvente sale sulla carta, portando con sé l'inchiostro, che si separa nei suoi componenti colorati.
Si tratta di un metodo semplice ma efficace per separare una miscela. Qui, scoprirai come funziona esattamente.
La cromatografia su carta è una tecnica analitica utilizzata per separare ed analizzare miscele di sostanze solubili. È un tipo di cromatografia.
- Questo articolo è dedicato al tipo di cromatografia nota come cromatografia su carta.
- Inizieremo ad esaminare i principi della cromatografia prima di applicarli nello specifico alla cromatografia su carta.
- In seguito, vedremo come funziona il metodo e imparerete a calcolare i valori Rf utilizzando un esempio che vi guiderà attraverso il processo.
- Successivamente, esamineremo come leggere i cromatogrammi e interpretare i risultati.
- Infine, analizzeremo i vantaggi e le applicazioni della cromatografia su carta.
Principi della cromatografia su carta
Tutti i tipi di cromatografia seguono lo stesso principio.
Si utilizzano due tipi di "fasi": la fase mobile e la fase stazionaria. Come suggeriscono i nomi stessi, la fase mobile indica il solvente che si muove sulla carta per sciogliere un campione di una miscela solubile. Il solvente trasporta la miscela su un solido chiamato fase stazionaria, che appunto non si muove.
Alcuni componenti della miscela vengono trasportati dal solvente verso l'alto più rapidamente di altri. I componenti che viaggiano più velocemente hanno una maggiore affinità con la fase mobile. Questa differenza di affinità ci aiuta a separare la miscela nelle sue parti ottenendo un cromatogramma.
Utilizziamo quindi le distanze percorse dai componenti per calcolare i valori Rf. Questi ci aiutano ad identificare i diversi componenti o analiti.
Se non l'hai ancora fatto, ti consigliamo di consultare la sezione Cromatografia per una spiegazione più dettagliata.
Vediamo ora cosa vogliono dire questi concetti in cromatografia su carta.
Fase stazionaria
La fase stazionaria può essere un solido, un liquido o un gel statico e viene attraversata dal solvente che trasporta con sè una miscela solubile.
Nella cromatografia su carta, la fase stazionaria è, come suggerisce il nome, la carta stessa. Tuttavia, la questione è un po' più complicata. La carta è fatta di cellulosa, un polimero del glucosio. Le fibre di cellulosa si legano al vapore acqueo presente nell'aria, insieme all'acqua presente al momento della produzione della carta. Si può pensare che la fase stazionaria sia una matrice complessa composta da acqua e carta, non solo dalla carta stessa.
Fase mobile
La fase mobile è il solvente (o miscela di solventi) utilizzato per trasportare il composto da analizzare attraverso la fase stazionaria.
La fase stazionaria - la carta - viene posta all’interno di un becker parzialmente riempito di solvente. Quest’ultimo è la nostra fase mobile. Nella cromatografia su carta, in genere si utilizza un solvente non polare. Il solvente risale sulla carta, portando con sé i diversi componenti della miscela e separandoli in base alla loro diversa affinità.
Fattore di ritenzione (Rf)
I componenti della miscela da analizzare risalgono la fase stazionaria (la carta) a velocità diverse. Ciò significa che, in un determinato periodo di tempo, i diversi componenti percorreranno distanze diverse. Vedremo a breve il perché di questo fenomeno.
Questi componenti sono visibili come macchie sul cromatogramma, che è il nome del tuo foglio una volta terminato l'esperimento. Il rapporto tra la distanza percorsa da ciascun componente e la distanza totale percorsa dal solvente fornisce i valori di Rf.
Per calcolare il valore Rf, devi dividere la distanza percorsa dal singolo componente - in altre parole, la distanza dalla linea della matita di partenza al punto colorato - per la distanza percorsa dal solvente.
I valori Rf sono importanti perché ogni componente ha un valore Rf fisso in determinate condizioni. Se si ripete l'esperimento, mantenendo esattamente la stessa fase mobile, la stessa fase stazionaria e la stessa temperatura, si otterrà sempre lo stesso valore Rf per lo stesso componente. Possiamo quindi confrontare i valori Rf con quelli presenti in un database per identificare i componenti della miscela.
Affinità relativa
Cosa determina la velocità con cui una sostanza percorre la carta? Tutto ciò ha a che fare con l'affinità relativa.
In cromatografia, l'affinità relativa descrive la capacità di un componente di essere attratto dalla fase stazionaria o dalla fase mobile. Determina la velocità con cui il componente si muove attraverso la fase stazionaria.
I componenti con maggiore affinità per la fase mobile si muoveranno più velocemente sulla carta rispetto a quelli con maggiore affinità per la fase stazionaria. Questo è perché sono più solubili nel solvente, vengono trasportati da quest’ultimo sulla carta percorrendo una distanza maggiore in un determinato periodo di tempo.
Analizziamo più da vicino le fasi mobili e stazionarie nella cromatografia su carta per capire perché alcuni componenti hanno una maggiore affinità con l'una o l'altra.
Ricordate che la fase stazionaria è una matrice di cellulosa e acqua? Ciò significa che è polare e può sperimentare forze dipolo-dipolo permanenti. Le molecole d'acqua possono anche formare legami a idrogeno con specifiche sostanze. Al contrario, la fase mobile nella cromatografia su carta è tipicamente non polare. Può formare solo forze deboli di van der Waals. Da ciò si può dedurre quanto segue:- Se i componenti della miscela sono polari o contengono gruppi chimici che possono formare legami a idrogeno, si legheranno più fortemente alla struttura polare cellulosa-acqua che al solvente non polare. Ciò significa che hanno una maggiore affinità con la fase stazionaria e saliranno più lentamente sulla carta. Questi componenti danno valori di Rf più bassi.
- Tuttavia, i componenti non polari si legano più fortemente al solvente non polare che alla carta polare. Sono più solubili. Pertanto, hanno una maggiore affinità con la fase mobile e salgono più rapidamente sulla carta. Questi componenti danno valori Rf più elevati.
Per ulteriori informazioni sulle forze dipolo-dipolo permanenti, sui legami a idrogeno e sulle forze di van der Waals, consultare la sezione Forze intermolecolari.
Esperimento di cromatografia su carta
Basta con i dettagli tecnici: come si esegue effettivamente un esperimento di cromatografia su carta?
Tracciare una linea a matita lungo il fondo di un foglio di carta cromatografica.
Aggiungere una goccia della miscela che si desidera analizzare al centro della linea a matita.
Posizionare il foglio di carta in un becker riempito con poco volume del solvente scelto. Assicuratevi che il livello del solvente sia al di sotto della linea della matita.
Mettere un coperchio sul becker e lasciare che il solvente risalga sulla carta, portando con sé i componenti della miscela.
Quando il livello del solvente raggiunge quasi la parte superiore della carta, rimuovere la carta dal becker e segnare la posizione del solvente con un altro segno di matita. Il cromatogramma è ora pronto per essere analizzato.
Qual è l'importanza, ad esempio, di tracciare la linea a matita? Ecco alcune delle ragioni alla base di particolari passaggi del metodo.
- Tracciamo la linea a matita perché è insolubile. Questo impedisce che essa stessa venga trasportata sulla carta con la fase mobile. Se usassimo l'inchiostro, ad esempio, anche quest'ultimo si scioglierebbe nel solvente e risalirebbe sulla carta, producendo risultati ambigui.
Il livello del solvente deve trovarsi al di sotto del punto della miscela per evitare che il punto si dissolva completamente nel solvente e venga spazzato via.
È inoltre necessario assicurarsi di maneggiare la carta dai bordi, per evitare di lasciare impronte su di essa rischiando di contaminarla. Ciò potrebbe sporcare la carta e dare risultati fuorvianti.
Utilizziamo un coperchio per mantenere l'ambiente saturo di solvente e per evitare che il solvente evapori. Si possono anche foderare i lati del becker con carta da filtro imbevuta di solvente per saturarlo ancora di più.
Figura 1. Setup cromatografia su carta.
Alla fine dell'esperimento, dovresti avere una situazione simile:
Figura 2.La fine di un esperimento di cromatografia su carta.
Il punto di inchiostro è salito sulla carta separandosi in diverse “macchie”. Ogni punto rappresenta un diverso componente presente nella miscela originaria. Ogni componente percorre la carta ad una velocità diversa, a seconda della sua affinità relativa con la fase stazionaria e della sua affinità relativa con la fase mobile.
Ora possiamo utilizzare questi risultati per calcolare i valori di Rf per ciascun punto.
Calcolo dei valori Rf
All'inizio dell'articolo abbiamo parlato dei valori Rf. Si tratta di valori che indicano il rapporto tra la distanza percorsa da ciascun componente e la distanza totale percorsa dal solvente.
Esaminiamo il calcolo dei valori Rf per il cromatogramma mostrato in precedenza.
- Misurare la distanza tra la linea della matita alla base della carta e una delle macchie colorate sul cromatogramma. Si tratta della distanza percorsa dal componente che ha prodotto quella macchia.
- Misurare la distanza tra la linea della matita alla base e la linea della matita utilizzata per segnare dove è arrivato il solvente. Questa è la distanza percorsa dal solvente.
- Dividere la distanza percorsa dal componente per la distanza percorsa dal solvente. Si ottiene così il valore Rf.
- Ripetere l'operazione per tutti i punti colorati.
Figura 3. Calcolo dei valori Rf per un cromatogramma su carta. Si noti che il solvente è evaporato: ecco perché abbiamo tracciato una linea a matita per segnarne la posizione.
Calcoliamo il valore Rf per la macchia verde. La macchia verde ha percorso 3,0 cm mentre il solvente ha percorso 9,8 cm. Dividere 3,0 per 9,8 per ottenere la risposta:
Tendiamo ad arrotondare i valori di Rf a due cifre decimali. Questo ci dà un valore Rf pari a 0,31.
Ricorda che la distanza percorsa da una sostanza dipende dalla sua affinità relativa per ciascuna fase. Una sostanza con una maggiore affinità per la fase stazionaria risalirà più lentamente sulla carta e percorrerà meno strada in un determinato periodo di tempo. Ciò significa che avrà un valore Rf più basso. Al contrario, una sostanza con una maggiore affinità per la fase mobile risalirà più rapidamente sulla carta e avrà un valore Rf più alto.
Analisi dei cromatogrammi
I cromatogrammi forniscono due informazioni importanti: .
- Il numero di diversi componenti nella nostra miscela di partenza.
- L'identità di ciascun componente della nostra miscela di partenza
Numero di componenti diversi
Ricordiamo che ogni punto rappresenta un diverso componente presente nella miscela di soluti originale. Nell'esempio precedente, abbiamo tre diverse macchie sul cromatogramma. Sappiamo quindi che sono presenti tre diverse sostanze.
Identità di ciascun componente
Esistono due modi per identificare le sostanze in un cromatogramma. Prima di tutto, quando si imposta l'esperimento, si può aggiungere una piccola goccia di una sostanza nota, come ad esempio un particolare amminoacido o una molecola organica, sulla linea della matita al lato della nostra miscela da analizzare. Questa sostanza aggiunta, essendo nota funge da molecola di riferimento. Anche quest’ultima verrà trasportata sulla carta dal solvente, producendo una macchia visibile. Se una delle macchie della tua miscela corrisponde alla macchia della sostanza nota, sai che quella sostanza è presente nella vostra miscela.
Sembra un po' confusionario? Ecco come si presenta.
Figura 4.Identificazione dei componenti nella cromatografia su carta.
La macchia rossa a sinistra proviene da una sostanza nota. Una delle macchie prodotte dalla nostra miscela corrisponde esattamente a questa. Possiamo quindi dedurre che la miscela contiene questa sostanza nello specifico.
Ma c'è un altro modo per identificare i diversi componenti. Abbiamo già detto che, a condizione di mantenere le stesse condizioni, un particolare componente produrrà sempre lo stesso valore Rf. Diciamo che un particolare componente ha un valore Rf di 0,4. Se cerchiamo in un database, dovremmo essere in grado di trovare una sostanza che produce anch'essa un valore Rf di 0,4 nelle stesse condizioni - stessa fase mobile, fase stazionaria e temperatura. Se così fosse, abbiamo trovato la sostanza a partire dal database!
La cromatografia bidimensionale utilizza invece due solventi diversi, uno dopo l'altro, sullo stesso campione. È utile per separare componenti con valori Rf molto simili.
Per eseguire questa tecnica, posizionare una piccola goccia di miscela su un bordo della linea di base della matita. Mettere la carta in un becker con il primo solvente, togliendolo quando il solvente ha quasi raggiunto la parte superiore della carta. Segnare la posizione di questo primo solvente.
La tua carta cromatografia dovrebbe avere questo aspetto.
Figura 5. Cromatografia bidimensionale.
Si noterà che due componenti producono un'unica macchia - non si sono separati chiaramente. Questo perché hanno affinità relative simili alla fase stazionaria e mobile e quindi hanno viaggiato a velocità simili sulla carta.
A questo punto, ruota il foglio di 90° in modo che le macchie separate si trovino ora lungo il fondo del foglio. Ripeti l'esperimento con un altro solvente. È improbabile che le due sostanze che hanno prodotto un’unica macchia abbiano affinità simili con le fasi stazionaria e mobile di questo solvente. Pertanto, le due sostanze percorreranno la carta a velocità diverse e si separeranno in macchie chiare e distinte.
Figura 6. Cromatografia bidimensionale.
Vantaggi della cromatografia su carta
La cromatografia su carta è una tecnica relativamente semplice. Tuttavia, ha i suoi vantaggi.
- È economica e facile da eseguire, con un'impostazione più semplice rispetto ad altri tipi di cromatografia.
- Utilizza solo piccole quantità di miscela campione.
- Può analizzare composti organici e inorganici.
Tuttavia, rispetto ad altre tecniche cromatografiche come la gas cromatografia e la cromatografia su strato sottile, la cromatografia su carta è meno accurata. Questo è uno dei suoi principali svantaggi.
Applicazioni della cromatografia su carta
La cromatografia su carta non significa semplicemente realizzare disegni colorati, è molto di più. Ha una varietà di usi diversi, molti dei quali condivisi con altre tecniche cromatografiche. Queste includono:
- Separazione di miscele. All'inizio del XX secolo, ad esempio, la cromatografia su carta era ampiamente utilizzata per separare gli estratti di piante.
- Ottenere composti puri e rimuovere le impurità.
- Analisi dei farmaci.
- Analisi delle acque reflue.
Cromatografia su carta - Punti chiave
La cromatografia su carta è una tecnica analitica utilizzata per separare ed analizzare miscele di sostanze solubili.
Nella cromatografia su carta, la fase stazionaria è un foglio di carta mentre la fase mobile è un solvente o una miscela di solventi.
È possibile identificare i componenti nella cromatografia su carta calcolando i loro valori Rf e confrontandoli con quelli di un database.
La cromatografia bidimesionale è una variante della cromatografia su carta che utilizza due solventi diversi per separare i componenti con valori Rf simili.
La cromatografia su carta è economica, semplice ed inoltre utilizza piccoli volumi di campione.
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