Molte compresse per uso farmaceutico sono formulazioni. Ciò significa che sono miscele complesse di sostanze chimiche diverse, accuratamente studiate per un uso specifico. Oltre al principio attivo, possono contenere anche aromi per mascherare l'eventuale sapore amaro, rivestimenti per facilitarne la deglutizione e amido per fungere da agente legante. Ma se volessimo isolare il principio attivo? Un modo per farlo è attraverso la cromatografia su colonna.
La cromatografia su colonna è una tecnica di separazione utilizzata per separare singoli componenti dall'interno di una miscela. È un tipo di tecnica cromatografica.
La cromatografia è una tecnica di separazione utilizzata per separare miscele solubili. Nella cromatografia su colonna, una miscela viene sciolta in un solvente e versata su una colonna riempita con un materiale solido. I diversi componenti della miscela fuoriescono dalla colonna a velocità diverse a seconda del loro adsorbimento al materiale solido. In questo modo, possiamo isolare e separare i diversi componenti.
- Questo articolo tratta della cromatografia su colonna in chimica.
- Inizieremo esplorando come i principi di base della cromatografia si applichino alla cromatografia su colonna prima di illustrare il metodo.
- In seguito, esamineremo i vantaggi e le applicazioni della cromatografia su colonna.
Cromatografia su colonna: definizione e principi
Tutti i tipi di cromatografia seguono gli stessi principi di base.
- Si utilizza un solvente, chiamato fase mobile, per sciogliere un campione di una miscela solubile. Il solvente trasporta la miscela attraverso un solido chiamato fase stazionaria.
- Alcuni componenti della miscela vengono trasportati dal solvente attraverso il solido più rapidamente di altri. I componenti che viaggiano più velocemente hanno una maggiore affinità con la fase mobile. In questo modo si separa la miscela nei suoi diversi componenti.
Vediamo ora come questo si applica alla cromatografia su colonna.
Fase stazionaria
La fase stazionaria è un solido, un liquido o un gel statico. In cromatografia, il solvente trasporta la miscela solubile attraverso la fase stazionaria.
Nella cromatografia su colonna, la fase stazionaria è costituita da microparticelle di un gel di silice fine impaccate in una lunga colonna di vetro. La colonna è aperta a un'estremità e dotata di un'apertura dall'altra. Sul fondo della colonna viene posto uno strato di lana di vetro per evitare che la polvere di silice venga lavata via.
Il gel di silice non è l'unica fase stazionaria utilizzabile. Si possono usare anche allumina, poliammide o acetato di cellulosa. Quando si cerca un mezzo adatto a fungere da fase stazionaria, si devono prendere in considerazione i seguenti fattori:
- Forma e dimensione delle particelle. Devono essere piccole e uniformi.
- Reattività. La fase stazionaria non deve reagire con il solvente.
- Costo e disponibilità.
- Facilità di smaltimento.
- Interazione con la miscela del campione. Idealmente, si desidera che alcuni componenti del campione abbiano un'affinità maggiore con la fase stazionaria rispetto ad altri: se tutte le loro affinità relative sono uguali, la miscela non verrà separata.
Fase mobile
La fase mobile è il solvente utilizzato per trasportare la miscela analizzata attraverso la fase stazionaria.
Nella cromatografia su colonna, la fase mobile può essere un qualsiasi solvente adatto. È anche nota come eluente. Si scioglie la miscela di campioni nel solvente e la si versa nella colonna in modo che attraversi la fase stazionaria.
Tempi di ritenzione
In altri tipi di cromatografia, come la Cromatografia su carta e la Cromatografia su strato sottile, possiamo calcolare i fattori di ritenzione. Si tratta di misure della distanza percorsa da ciascun componente della miscela attraverso la fase stazionaria rispetto alla distanza complessiva percorsa dal solvente. Nella cromatografia su colonna, invece, si calcolano i tempi di ritenzione.
Il tempo di ritenzione è il tempo impiegato da un particolare componente della miscela di campioni per attraversare la colonna. In altre parole, è il tempo che intercorre tra l'iniezione del campione e la rilevazione del componente.
In altri tipi di cromatografia, lo stesso soluto ha sempre lo stesso fattore di ritenzione, a condizione che tutte le condizioni siano mantenute invariate: la temperatura, la fase stazionaria e la fase mobile, ad esempio.
Ma è molto più difficile produrre tempi di ritenzione coerenti. Questo perché dipendono da molti fattori. Tra questi, la lunghezza della colonna, la dimensione delle particelle della fase stazionaria etc. Per questi motivi, la cromatografia su colonna non viene utilizzata per identificare le sostanze. L'identificazione viene lasciata ad altre tecniche, come la spettrometria di massa o cromatografia HPLC.
Cromatografia HPLC
La cromatografia HPLC (dall'inglese high performance liquid cromatography), è una tecnica cromatografica che si basa sugli stessi principi della cromatografia su colonna tradizionale ma con strumentazioni avanzate e pompe ad alta pressione. Pur avendo costi molto più elevati rispetto alla cromatografia su colonna avanzata, ha applicazioni innumerevoli in diversi campi a livello industriale.
Affinità relativa
In cromatografia, l'affinità relativa descrive la capacità di un componente di legarsi alla fase stazionaria o mobile. Determina la velocità con cui il componente si muove attraverso la fase stazionaria.
Una sostanza con maggiore affinità per la fase mobile si muove più velocemente attraverso la fase solida della colonna rispetto a quelle con maggiore affinità per la fase stazionaria. L'affinità relativa ha a che fare con il legame tra la sostanza e la fase stazionaria o mobile.
Esaminiamo la struttura della fase stazionaria, il gel di silice. È nota anche come biossido di silicio. Ogni particella di silice ha uno strato di gruppi -OH all'esterno, come mostrato di seguito:
Figura 1. Silice.
Questi gruppi -OH fanno sì che la silice possa formare legami idrogeno con le sostanze adatte. I legami a idrogeno sono un tipo di forza intermolecolare. Questi legami mantengono la sostanza in posizione e impediscono che il solvente la trasporti lungo la colonna con la stessa velocità. Possiamo quindi prevedere quanto segue:
Le sostanze che possono formare legami idrogeno si legheranno più fortemente al gel di silice e avranno quindi una maggiore affinità con la fase stazionaria e una minore affinità con la fase mobile. Si muoveranno più lentamente lungo la colonna e daranno tempi di ritenzione più elevati. Si dice che sono maggiormente adsorbite.
Le sostanze che non possono formare legami idrogeno si legano meno fortemente al gel di silice. Esistono ancora altre forze intermolecolari tra loro, ma sono più deboli dei legami idrogeno, quindi la sostanza si muove più rapidamente lungo la colonna. La sostanza ha una maggiore affinità con la fase mobile e una minore affinità con la piastra stazionaria. Queste sostanze sono più solubili nel solvente e danno tempi di ritenzione più elevati.
Ad esempio, gli amminoacidi possono formare legami a idrogeno perché contengono un gruppo N-H. Gli alcheni, invece, non possono farlo. Gli amminoacidi hanno quindi un'affinità più forte con la fase stazionaria rispetto agli alcheni e quindi hanno tempi di ritenzione più elevati. Un alchene attraverserà la colonna più velocemente rispetto amminoacido.
Procedimento della cromatografia su colonna
Come si esegue la cromatografia su colonna? Si procede come segue.
- Posizionare uno strato di lana minerale sul fondo della colonna e poi riempire la colonna con gel di silice; questa è la fase stazionaria.
- Saturare il gel di silice con il solvente: questa è la fase mobile.
- Versare la miscela di campioni nella parte superiore della colonna.
- Aprire il rubinetto sul fondo della colonna mentre si versa continuamente il solvente nella parte superiore della colonna. Lasciare che il solvente trasporti il campione attraverso il gel di silice e raccogliere l'eluente che fuoriesce dal fondo.
Ecco come dovrebbe apparire la colonna dopo aver versato la miscela nella parte superiore.
Figura 2. Set up di un esperimento di cromatografia su colonna.
La miscela dovrebbe separarsi in diversi componenti che si muovono attraverso la colonna a velocità diverse. Assicuratevi di scambiare il becher con uno nuovo quando ogni componente raggiunge la fine della colonna.
Figura 3. Cromatografia su colonna.
Osservate l'esempio precedente. La miscela campione verde si divide in due componenti diversi, uno blu e uno giallo. Sappiamo quindi che la miscela è composta da due sostanze diverse. Possiamo anche notare che il componente giallo si muove più velocemente attraverso la colonna rispetto al componente blu. Ciò significa che il componente giallo ha un tempo di ritenzione più breve e una maggiore affinità con la fase mobile rispetto al componente blu. Si dice che il componente blu è adsorbito più del componente giallo - ha un'affinità maggiore e si lega più fortemente alla fase stazionaria.
Una volta raccolti i componenti del campione in diversi becher, è possibile analizzarli ulteriormente. Ad esempio, si può eseguire spettrometria di massa o cromatografia su strato sottile su uno dei componenti per scoprirne l'identità. Potreste purificarlo rimuovendo il solvente. Un modo per farlo è la distillazione. Oppure si possono semplicemente eseguire alcune reazioni di base in provetta per ottenere alcuni indizi sulla struttura e sulla reattività del componente.
Cromatografia su colonna a bassa pressione
La cromatografia su colonna a bassa pressione è un altro tipo di tecnica cromatografica che, come dice il nome stesso, utilizza pompe a pressioni basse per forzare la fase mobile all'interno della colonna. Questo tipo di tecnica trova applicazioni soprattutto nella separazione di identificazione di biomolecole e proteine.
Vantaggi della cromatografia su colonna
Ora che sappiamo come funziona la cromatografia su colonna, possiamo considerare alcuni dei suoi vantaggi.
- È possibile analizzare grandi quantità di un campione. Ciò è utile per separare le miscele.
- La fase stazionaria è generalmente a basso costo e facile da smaltire.
- Ha un'ampia varietà di applicazioni potenziali, a seconda del solvente utilizzato.
Applicazioni della cromatografia su colonna
La cromatografia su colonna ha una serie di applicazioni reali. Tra queste vi sono:
- Isolamento di principi attivi, di cui abbiamo parlato all'inizio dell'articolo.
- Separazione di miscele, come ad esempio una miscela di aminoacidi.
- Isolamento di metaboliti da campioni biologici.
- Rimozione di impurità
Cromatografia su colonna - Punti chiave
- La cromatografia su colonna è una tecnica di separazione utilizzata per separare singoli componenti da una miscela disciolta in un fluido. È un tipo di tecnica cromatografica.
- Nella cromatografia su colonna, la fase stazionaria è una colonna riempita di gel di silice e la fase mobile è un solvente versato nella parte superiore della colonna.
- Per eseguire la cromatografia su colonna, si versa il campione nella parte superiore della colonna e si versa il solvente in un flusso continuo. Il campione si separa nei suoi singoli componenti che si muovono attraverso la colonna a velocità diverse.
- La cromatografia su colonna è economica e può essere utilizzata su larga scala.
- La cromatografia su colonna viene utilizzata per separare miscele, isolare principi attivi e rimuovere impurità.
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