Immagina di imbatterti un giorno in un liquido incognito e di voler sapere di cosa si tratti. Fortunatamente sei uno scienziato che ha accesso alle strutture di laboratorio. Sai che in laboratorio hai un database di valori Rf noti per diverse sostanze, una matita, uno strato sottile di carta e del solvente. Che cosa si può fare con tutto questo? Si può eseguire la cromatografia su strato sottile, che esploreremo in questo articolo.
- Esploreremo che cos'è la cromatografia su strato sottile.
- Vedremo il principio della cromatografia su strato sottile.
- Vedremo come si presenta un diagramma della cromatografia su strato sottile.
- Infine, esploreremo il metodo della cromatografia su strato sottile.
Che cos'è la cromatografia su strato sottile?
La cromatografia in generale è un metodo che utilizziamo per separare i diversi componenti di una miscela. Questo metodo ha quasi 120 anni! Il funzionamento della cromatografia dipende dalle caratteristiche dei diversi componenti e dalla loro affinità con le diverse fasi. Inoltre, possiamo distringuere diversi tipi di cromatografia, come la gascromatografia, la cromatografia di partizione, la cromatografia su colonna, la cromatografia su strato sottile e molte altre.
In questo articolo ci concentreremo sulla cromatografia su strato sottile.
La cromatografia su strato sottile (nota anche come TLC dall'inglese Thin Layer Chromatography) è una tecnica analitica che viene utilizzata per separare i componenti all'interno di una miscela.
Il principio della cromatografia su strato sottile, stabilisce fondamentalmente quali sono le caratteristiche necessarie per il suo funzionamento e da cosa dipende la tecnica. In particolare, per la cromatografia su strato sottile si fa affidamento su componenti con diverse solubilità e sull'adsorbimento sulla fase solida.
Diamo due definizioni importanti per trattare l'argomento.
Non volatile: una sostanza che non vaporizza facilmente.
Adsorbimento: adesione di una molecola a una superficie.
Principio della cromatografia su strato sottile
Il principio su cui si basa la cromatografia su strato sottile, è la separazione dei componenti del campione contenuti in una miscela. Questo avviene a seconda delle interazioni e quindi dell'affinità dei componenti per la fase stazionaria o per la fase mobile. In particolare si può affermare che:
- Se il componente ha una affinità maggiore con la fase mobile, eluirà piuttosto velocemente.
- Se invece il componente ha una maggiore affinità con la fase stazionaria, eluirà più lentamente.
Ma cosa sono la fase mobile e la fase stazionaria?
La fase stazionaria o fase solida, in questo caso, è un sottile strato di materiale adsorbente generalmente gel di silice, cellulosa o allumina che è più polare della silice ed è disponibile in una forma acida, neutra o basica. La fase solida è fissata su una lastrina di TLC in vetro o plastica. Il campione viene spruzzato su un'estremità della piastra TLC e posto verticalmente in una camera chiusa con la fase mobile, ovvero un solvente. La fase mobile è quindi il solvente di eluizione e può essere un solvente polare o non polare, scelto in base al composto incognito che stiamo cercando di identificare.
Il solvente di eluizione o eluente utilizzato in cromatografia può essere sia un liquido che un gas. Generalmente si utilizza un solvente organico o una miscela con minor polarità (i solventi più polari hanno maggiore forza eluente. La polarità è importante per la scelta dell’eluente poichè è da essa che dipende l’entità del trascinamento dei componenti lungo la lastrina in una TLC.
Diagramma cromatografia su strato sottile
Come si presenta esattamente un cromatogramma a strato sottile? Il diagramma presenta il cosiddetto serbatoio cromatografico. All'interno del serbatoio possiamo vedere il solvente, che è la fase mobile, la piastra TLC che è la fase stazionaria e infine il fronte del solvente, che mostra la distanza percorsa dalla fase mobile.
Procedimento cromatografia su strato sottile
Abbiamo già spiegato cos'è la cromatografia su strato sottile, i principi della cromatografia su strato sottile e l'aspetto di un set up di cromatografia su strato sottile. Vediamo ora come eseguire esattamente una cromatografia su strato sottile.
1. Per prima cosa dobbiamo indossare i guanti e tracciare con attenzione una linea orizzontale alta circa 1 cm sulla lastrina TLC, utilizzando una matita. Segnare con la matita dei punti equidistanti in cui si intende depositare il campione. L'utilizzo dei guanti impedisce qualsiasi contaminazione mentre la matita viene utilizzata perché non si scioglie nel solvente.
Figura 1. Capillari in vetro. Fonte: commons.wikimedia.org
2. Succesivamente, con un tubo capillare, versare piccole gocce delle diverse soluzioni che si stanno testando nei punti precedentemente segnati sulla lastrina e lasciare asciugare.
3. Immergere l'estremità della cartina TLC nella camera di eluizione e aggiungere 1 cm di solvente. La camera di eluizione in vetro deve essere coperta con un coperchio.
4. A questo punto, posizionare la piastra nel contenitore e assicurarsi che il solvente sia al di sotto della linea della matita, quindi posizionare il coperchio e assicurarsi che sia ben chiuso. Il coperchio garantisce che il solvente non fuoriesca.
5. Attendere che il solvente percorra l'intera lastrina TLC. Rimuovere poi la lastrina dalla camera di eluizione e lasciare quindi asciugare la lastra in una cappa di aspirazione. È importante assicurarsi che l'asciugatura avvenga in una cappa di aspirazione, poiché i fumi del solvente potrebbero essere tossici.
6. Qualora non sia possibile osservare direttamente le macchie sulla superficie della lastrina, si può analizzare la lastra TLC alla lampada UV cerchiando le macchie con una matita oppure si può ricorrere all'utilizzo di reagenti che sviluppano composti colorati come lo iodio o la para-anisaldeide.
Ora possiamo finalmente analizzare i diversi componenti.
Analisi di un cromatogramma
Dopo aver eseguito manualmente l'esperimento, dobbiamo individuare i singoli componenti. Questo può essere determinato utilizzando i valori Rf per cui esiste un ampio database che contiene valori Rf di riferimento di diversi componenti. Tuttavia, per determinare il valore Rf si misura la distanza percorsa dalla fase mobile e quindi dal solvente. Più lunga è la distanza percorsa, meno il componente incognito si è adsorbito sulla fase stazionaria e ci permette di esplorare la rispettiva solubilità.
Per trovare il valore di Rf si utilizza questa equazione:
Rf = Distanza percorsa dal componente ÷ Distanza percorsa dal solvente
Innanzitutto, si misura la distanza percorsa dal componente. A tal fine, si misura la distanza dalla linea della matita al centro della macchia del componente. Successivamente, misuriamo la distanza del solvente dalla linea della matita, nota anche come fronte del solvente. Inseriamo quindi questi dati nell'equazione precedente. Il valore ottenuto è il valore Rf del componente. Possiamo quindi confrontarlo con valori noti e determinare il componente.
| Componente | Valore Rf |
| β-carotene | 0.98 |
| Clorofilla a | 0.59 |
| Clorofilla b | 0.42 |
Tabella 1. Valori Rf di diversi composti.
Supponiamo che il solvente abbia percorso 1,6 cm e che il componente abbia percorso 1,57 cm.
1,57 ÷ 1,6 = 0,98
Utilizzando i valori noti della tabella precedente, possiamo determinare che il componente incognito è il β-carotene.
Applicazioni della cromatografia su strato sottile
La cromatografia su strato sottile è utilizzata in diversi settori, dall'analisi di prodotti famaceutici, dell'acqua e dei pesticidi, ai cosmetici o per i test clinici. Possiamo quindi riassumere i suoi usi comuni:
- Identificare i diversi componenti di una miscela.
- Determinare l'esito di una reazione chimica.
- Determinare la purezza di una sostanza.
- Screening rapido e ad alto rendimento prima dell'HPLC.
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